摘要：從我國(guó)云南地區(qū)采集藥用植物密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）植株為樣品，采用稀釋涂布平板法進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，以香蕉枯萎病菌4號(hào)小種為靶標(biāo)菌，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)的生防菌株2株，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性比對(duì)并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對(duì)這2種菌株進(jìn)行鑒定，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定其內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)感病香蕉的抑菌活性。結(jié)果表明：經(jīng)鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1 菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌），這2種菌株對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲抑制率分別為 5446%、 7012%。所分離的菌株對(duì)多種植物病原真菌均有抑制效果，為無(wú)環(huán)境公害型微生物資源的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：密毛山梗菜；內(nèi)生放線菌；香蕉枯萎菌；鑒定；次生代謝產(chǎn)物；抗菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.68+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0199-04

密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）為半邊蓮科半邊蓮屬植物，民間用于治療腮腺炎、跌打損傷、風(fēng)濕痛、疹癥，全草或根、葉（有毒）藥用，分布于云南西南部至南部。其提取物中分離的齊墩果酸存在于許多中草藥中，生理活性較為廣泛，對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾后合成的齊墩果酸磷酸醋單鈉，經(jīng)體外藥理試驗(yàn)證實(shí)，其抗腫瘤活性比齊墩果酸高5倍[1-2]。

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，簡(jiǎn)稱(chēng)Foc）侵染而引起的危害香蕉生產(chǎn)的毀滅性土傳真菌病害，該病可導(dǎo)致植物莖葉萎蔫，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，是世界上分布最廣、危害最大、造成損失最嚴(yán)重的植物土傳病害之一[3]。為了減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用，應(yīng)用生物防治方法對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行綜合防控已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[4]。戴青冬等對(duì)抗香蕉枯萎病生防菌進(jìn)行了篩選及生防效應(yīng)方面的研究[5]。胡偉等報(bào)道了添加生防菌株解淀粉芽孢桿菌的生物有機(jī)肥在不同耕作模式下對(duì)香蕉生長(zhǎng)和香蕉枯萎病防治效果的影響，發(fā)現(xiàn)這種菌株有機(jī)肥能降低香蕉枯萎病病情指數(shù)[6]。目前防治香蕉枯萎病的生防菌株主要有以下幾大類(lèi)：生防細(xì)菌、生防真菌、生防放線菌等[7-9]。本研究以云南密毛山梗菜作為試驗(yàn)材料，分離出2株對(duì)香蕉枯萎病菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生放線菌DJ15、XLG-1。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性比對(duì)并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，對(duì)其進(jìn)行抗菌活性和次級(jí)代謝產(chǎn)物活性進(jìn)行研究，為其今后應(yīng)用于香蕉枯萎病的防治提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集密毛山梗菜植株樣品采集于云南省西雙版納植物園（地理位置109°51′17″E、19°47′1″N），樣品分為根、莖、葉3份，采集后混勻，置于無(wú)菌封口袋中，封口，放入冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌DNA 提取試劑盒，北京博邁德生物公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶，愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒；引物合成、測(cè)序由華大基因完成。

1.1.3供試病原菌本研究篩選拮抗菌所用病原菌為香蕉枯萎病菌4號(hào)小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。放線菌多抗性測(cè)試病原菌有香蕉長(zhǎng)形斑病原菌（Curvularia fallax）、香蕉大灰斑病原菌（Curvularia lunata）、香蕉炭疽病原菌（Colletotrichum musae）、草莓炭疽病原菌（C. fragariae）、辣椒炭疽病原菌（C. acutatum）、膠孢炭疽病原菌（C. gloeosporioides）、香蕉樹(shù)木潰瘍病原菌（Botoryosphaeria dothidea）、貢蕉煙頭病原菌（Fusarium spp.）、香蕉葉緣枯斑病原菌（Alternaria musae）。此外，還有灰葡萄孢菌病原菌（Botrytis cinerea）等。菌源均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.4供試培養(yǎng)基采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行分離，滅菌后在1 L培養(yǎng)基中加入3 mL經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌處理的1%重鉻酸鉀溶液、0.5 mL 5%制霉菌素；采用酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基純化菌株、保藏，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察；采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)；采用酵母膏麥芽膏（YE）液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株發(fā)酵。

1.2內(nèi)生放線菌的分離

具體分離方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.3拮抗放線菌的篩選

具體篩選方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.4菌株鑒定

1.4.1形態(tài)與培養(yǎng)特征觀察具體方法參照文獻(xiàn)[12-14]。

1.4.2生理生化特征具體方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.4.3系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取樣品DNA；采用細(xì)菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增；產(chǎn)物純化后測(cè)定基因序列；采用EzTaxon與GenBank搜索序列相似性，選取相似性最高的模式菌序列，用MEGA5.0中的鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）法比較同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5菌株抗菌活性評(píng)價(jià)

1.5.1平板對(duì)峙對(duì)病原菌的拮抗作用將拮抗放線菌與香蕉炭疽病菌等11種病原真菌于28 ℃對(duì)峙培養(yǎng)7～14 d，以不接拮抗菌的平板為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，以抑菌帶寬度來(lái)衡量菌株對(duì)病原真菌的抑制作用。

1.5.2混合菌液對(duì)病原菌的拮抗作用以及對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[16-17]。

1.5.3次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1放線菌的分離與篩選

根據(jù)分離的菌株在純化培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顏色去重，獲得126株放線菌；經(jīng)過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選后，得到產(chǎn)生抑菌圈最大的2株放線菌，分別編號(hào)為DJ15、XLG-1。

2.2菌株DJ15、XLG-1的分類(lèi)鑒定

2.2.1形態(tài)特征菌株DJ15的基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)、不斷裂，氣生菌絲多分枝，孢子絲波曲狀，孢子呈橢圓形，表面光滑。

2.2.2培養(yǎng)特征菌株DJ15、XLG-1在供試的7種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，其菌落形態(tài)特征見(jiàn)表1。

2.2.4系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征將所獲得的DJ15、XLG-1菌株的16SrDNA序列通過(guò)EzTaxon與GenBank上登錄的序列進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)，得到21株分別與菌株DJ15、XLG-1同源性最高、已定名的模式菌的序列信息，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，可見(jiàn)DJ15菌株與Streptomyces yatensis NBRC 101000T （AB249962）同源性最高，可達(dá)99.96%；XLG-1菌株與Streptomyces kasugaensis M338-M1T （AB024441）、Streptomyces celluloflavus NRRL B-2493T （JOEL01000102）2株菌同源性最高，均為99.09%，且均處于同一分支。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征比對(duì)，鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌）。

2.3菌株抗菌活性評(píng)價(jià)

2.3.1菌株抑菌譜測(cè)定平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果（表3） 表明，菌株DJ15、XLG-1抑菌效果較廣，對(duì)供試的11種植物病原真菌菌絲的抑制率均超過(guò)50%，具有較好的抑制效果。2種菌株對(duì)病原真菌抑制作用中，XLG-1對(duì)貢蕉煙頭病原菌的抑制率為74.99%，抑菌帶寬度達(dá)到2.16 cm，抑制作用最強(qiáng)。除了DJ15對(duì)香蕉長(zhǎng)形斑病原菌、灰葡萄孢菌原菌、草莓炭疽病原菌及香蕉炭疽病原菌的抑菌帶寬度小于1.5 cm， 其余的

2.3.2次生代謝產(chǎn)物對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制作用菌株DJ15、XLG-1不同濃度的發(fā)酵液對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種分生孢子的萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，發(fā)酵液原液的抑制率最高，10%發(fā)酵液抑制率則最低，發(fā)酵濾液濃度增加至50%時(shí)，病原菌孢子的裂解增加（表4），說(shuō)明隨著拮抗菌發(fā)酵濾液濃度增加，濾液對(duì)病原菌孢子的生長(zhǎng)抑制作用也增強(qiáng)。

2.3.3次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制作用菌株DJ15、XLG-1的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)11種供試植物病原真菌都有較好的抑制效果（表5）。其中DJ15對(duì)香蕉樹(shù)木潰瘍病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)到2.11 cm；XLG-1對(duì)貢蕉煙頭病原菌的抑制作用作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)到2.62 cm；2種菌株對(duì)香蕉枯萎病4號(hào)小種均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬無(wú)明顯差異性，分別為1.99、2.40 cm。

3討論和結(jié)論

隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的日益重視，目前利用生防菌防治香蕉枯萎病病害已是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重要內(nèi)容，但是由于微生物定殖能力不強(qiáng)，容易受濕度、溫度、化學(xué)農(nóng)藥和其他環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致生物防治的效果不穩(wěn)定，從而限制了微生

戴青冬等通過(guò)對(duì)香蕉進(jìn)行施用BLG01、BDF11與有機(jī)液肥的試驗(yàn)，篩選出高效生防枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis BLG01和BDF11，這2種菌株對(duì)香蕉枯萎病病原菌的抑制率最高可達(dá)77%[5]。然而從植株內(nèi)尤其是藥用植物內(nèi)分離篩選出的微生物用于香蕉枯萎病的防治卻鮮有報(bào)道。本研究中，從藥用植物密毛山梗菜中分離篩選鑒定出的菌株，對(duì)香蕉枯萎病菌在內(nèi)的11種病原菌具有廣譜抗性，特別是對(duì)香蕉枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)54.46%、70.12%，抑制效果良好。原因可能是這些生防菌能抑制病原菌，降低土壤中的尖孢鐮刀菌數(shù)量，使病害得到了有效控制[5]。由于內(nèi)生菌生長(zhǎng)于植株內(nèi)，不易受外界環(huán)境影響，具有可以在植物體內(nèi)定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)的特殊性質(zhì)[25]，按照內(nèi)共生理論，內(nèi)生菌可能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，因此從藥用植物中分離具有抗菌活性放線菌，成為病害生物防治中具有潛力的微生物農(nóng)藥。

譚力等通過(guò)對(duì)銀杏內(nèi)生放線菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)由分離、篩選得到具有抑菌作用的菌株KLBMP 5501為淺紫鏈霉菌Streptomyces violascens[20]。本研究從密毛山梗菜體內(nèi)分離到2株對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種拮抗作用較強(qiáng)的菌株DJ15、XLG-1，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rDNA 序列分析，鑒定出DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為纖維黃鏈霉菌（Streptomyces celluloflavus），目前還未發(fā)現(xiàn)2株菌應(yīng)用于土傳病害防治方面的報(bào)道。同時(shí)該菌株發(fā)酵濾液對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種的孢子萌發(fā)抑制率隨著稀釋濃度變化而變化，其中原液對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種的孢子萌發(fā)抑制率最大，分別為84.44%、89.10%，表明該菌株的次生代謝產(chǎn)物含有抑菌物質(zhì)，值得對(duì)DJ15、XLG-1菌株在植物病害的防治、抗生素的分離純化及其抑菌機(jī)理等方面進(jìn)行深入研究。目前，從密毛山梗菜中分離得到的內(nèi)生放線菌應(yīng)用于防治植物病害的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此開(kāi)展對(duì)DJ15、XLG-1菌株在植株體內(nèi)定殖、田間應(yīng)用、次生代謝產(chǎn)物的分離、生防菌劑的研制等方面作深入研究具有一定的實(shí)踐意義，為進(jìn)一步優(yōu)化提高抑菌活性以及后期大田生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊靖華，馬妮，李良，等. 大將軍化學(xué)成分研究（I）[J]. 中草藥，2000，31（12）：898-943.

[2]國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站. 植物藥有效成分手冊(cè)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：1003.

[3]張志紅，彭桂香，李華興，等. 生物肥與甲殼素和惡霉靈配施對(duì)香蕉枯萎病的防治效果[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31（4）：1149-1156.

[4]王清紅，李培征. 香蕉枯萎病生物防治研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：10747-10748.

[5]戴青冬，汪軍，邢益范，等. 兩株抗香蕉枯萎病生防菌的篩選與生防效應(yīng)研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，1：73-77.

[6]胡偉，趙蘭鳳，張亮，等. 不同種植模式配施生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防治效果研究[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2012，18（3）：742-748.

[7]Paulitz T C，Bélanger R R. Biological control in green house systems[J]. Annual Review Phytopathology，2001，39：103-133.

[8]陳捷，朱潔偉，張婷，等. 木霉菌生物防治作用機(jī)理與應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（2）：145-151.

[9]丁文娟，曹群，趙蘭鳳，等. 生物有機(jī)肥施用期對(duì)香蕉枯萎病及土壤微生物的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（8）：1575-1582.[ZK）]

[10]魏玉珍，張玉琴，趙莉莉，等. 廣西山口紅樹(shù)林內(nèi)生放線菌的分離、篩選及初步鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（6）：823-828.

[11]程麗娟，薛泉宏，來(lái)航線，等. 微生物與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 西安：世界圖書(shū)出版公司，2000.

[12]四川抗菌素工業(yè)研究所新抗菌素研究室. 鏈霉菌鑒定法[J]. 抗菌素，1976，4：96-107.

[13]閻遜初. 放線菌的分類(lèi)和鑒定[M]. 北京：科學(xué)出版社，1992.

[14]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類(lèi)組. 鏈霉菌鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1975.

[15]中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類(lèi)組. 一般細(xì)菌常用鑒定方法[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978：135-182.

[16]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測(cè)定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[17]盧娟，夏啟玉，孫建波，等. 一株拮抗香蕉枯萎病菌的鏈霉菌分離與鑒定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（2）：278-28.

[18]徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：651.

[19]Wellman-Labadie O，Lemaire S，Mann K，et al. Antimicrobial activity of lipophilic avian eggshell surface extracts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（18）：10156-10161.

[20]譚力，袁博，秦盛，等. 邳州銀杏內(nèi)生放線菌分離、篩選及活性菌株鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（6）：1043-1051.

[21]Thangavelu R，Palaniswami A，Doraiswamy S，et al. The effect of Pseudomonas fiuorescens and Fusarium oxysporum f. sp. cubense on induction of defence enzymes and phenolics in banana[J]. Biologial Plantanum，2003，46（1）：107-110.

[22]茹祥，曾濤，莫坤聯(lián)，等. 海南吊羅山原始林區(qū)抗香蕉枯萎病土壤放線菌的分離及田間防治效果試驗(yàn)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（13）：97-102.

〖FQ（6。54，ZX，DY-W〗[KH*4D]

[23]秦涵淳，楊臘英，李松偉，等. 香蕉鐮刀菌枯萎病拮抗放線菌的分離篩選及其抑制效果的初步評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)生物防治，2010，26（2）：174-180.

[24]Chen C Y，Wang Y H，Huang C J. Enhancement of the antifungal activity of Bacillus subtilis F29-3 by the chitinase encoded by Bacillus circulans chiA gene.[J]. Canadian Journal of Microbiology，2004，50（6）：451-454.

[25]Lodewyckx C，Vangronsveld J，Porteous F，et al. Endophytic bacteria and their potential applications[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，2002，21（6）：583-606.

[FQ）]

推薦訪問(wèn)： 放線菌 枯萎 香蕉 鑒定 內(nèi)生