材料的特殊性，相較于動物，植物多肽組學的發展仍較為緩慢。在本研究中，筆者參考動物多肽組的純化過程[10-11]和植物蛋白質組的提取方法[12-13]，對棉花根部的多肽提取方法進行探索和建立，利用高分辨級色譜質譜聯用儀，對所提取的多肽進行NanoLC-MS/MS（納升級液相色譜串聯質譜）分析，利用已發表的棉花蛋白數據庫進行搜索比對，并手動驗證質譜的分析結果。本研究將為系統研究棉花多肽組的生物學信息和挖掘具有重要應用價值的新多肽提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試棉花材料為亞洲棉中棉紅莖，由江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所張保龍研究員提供。

1.2 試驗時間和地點

本試驗于2018年3月至2019年4月進行，試驗在江蘇省農業科學院種質資源與生物技術研究所江蘇省重點實驗室及南京農業大學生命科學學院完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 棉花根部多肽的分離提取 將亞洲棉中棉紅莖的種子用清水沖洗后，播種于盆缽中，待幼苗長至2葉1心時，采集植物的根部組織進行多肽提取。用液氮研磨葉片至粉末狀后，加入3倍體積的多肽提取液[含有7 mol/L尿素，2 mol/L硫代尿素，20 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），5 μL Cocktail蛋白酶抑制劑]，振蕩提取15 min后，離心（4 ℃，12 000×g，10 min），取上清。上清液通過Microcon YM-10超濾管（Millipore，USA）除去分子量大于10 ku的大分子蛋白。在過濾后的上清中加入3倍體積的預冷丙酮，于-20 ℃放置4 h。離心取沉淀（4 ℃，12 000×g，10 min），沉淀再用1倍體積的預冷丙酮洗1次，離心（4 ℃，12 000×g，5 min），棄上清，將沉淀倒置晾干。將沉淀加入70%乙腈[含0.1%TFA（三氟乙酸）]中，振蕩提取15 min，離心取上清（4 ℃，12 000×g，5 min）。用Millipore Ziptips（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）對上清液進行脫鹽處理，最終收集后抽真空干燥。將處理后的樣品用0.1%甲酸復溶，離心（4 ℃，12 000×g，2 min），取上清液進行Nano LC-MS/MS分析。

1.3.2 Nano LC-MS/MS分析分離鑒定 將多肽樣品于Nano-RSLC液相系統（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）中進行60 min的梯度洗脫，流速為300 nL/min，進樣量為 10 μL。采用納升電噴霧離子源，電離模式：電噴霧ESI（+），噴霧電壓為2.2 kV，毛細管溫度為200 ℃。一級質譜在Orbitrap中掃描，掃描范圍是350～1 800 m/z，分辨率為 60 000。所得信息用PEAKS軟件進行De Novo（從頭）測序，并用測得的序列搜尋棉花蛋白數據庫，以得到最合適的鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 棉花根部多肽的提取效果

植物內源多肽的豐度通常都非常低，并且植物細胞外的細胞壁中及細胞內含有大量色素，加上存在的次級代謝物等為多肽的獲得和分離帶來了極大困難。本研究由于后續應用高分辨率的色質聯用儀，因此在提取方法上排除了與色譜不相容的十二烷基硫酸鈉（SDS）法，筆者采用對分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法進行棉花多肽的提取。為了避免蛋白質和多肽的降解，本試驗在樣品采集和提取過程中始終保持在低溫（4 ℃）下進行，并且在提取液中加入蛋白酶抑制劑。質譜分析后用PEAKS studio軟件進行數據處理，將從頭測序、數據庫搜索2種方法結合進行多肽的鑒定。筆者從棉花根部組織共獲得809個小分子肽序列，詳見表1。這一結果表明，采用的改良尿素法對棉花多肽的分離效果較好。這些多肽的長度均較小，最大不超過70個氨基酸，以長度為10～20個氨基酸的多肽最多，其次為20～30個氨基酸長度的多肽。

2.2 棉花根部多肽的功能分類

由圖1可見，通過比對棉花蛋白數據庫，發現737個多肽可以匹配到已知蛋白上。通過對這些已知蛋白進行GO注釋，筆者發現這些多肽來源的基因在結合和催化活性、細胞過程、代謝過程功能亞類中所占的比例最高（圖1）。從未來生產應用角度，本研究還發現了與抗病防衛相關的蛋白包括病程相關蛋白10（PR10）、包含NB-ARC結構域的蛋白、過氧化氫酶、氧化還原酶等來源的多肽。例如，本研究發現病程相關蛋白10來源多肽的多個多肽，這些多肽除了序列較短，還伴有甲酰化、脫酰胺基化、乙基化等10種以上的氨基酸修飾方式，詳見圖2。

2.3 棉花根部多肽的定位

筆者將多肽的來源基因進行亞細胞定位預測。圖3的預測結果顯示，根部多肽來源的基因大多分布在細胞質中（52%），其次分別分布在細胞核（23%）、質體（20%）中，此外，還有少量多肽分布于細胞質膜、內質網膜上、過氧化物酶上等。

3 討論與結論

在動物細胞及動物組織中，多肽和多肽組的提取方法較為成熟，然而在植物中，由于植物細胞結構的特殊性，目前植物多肽組的提取仍然是多肽組學研究中的關鍵步驟。在蛋白質組的提取過程中，常使用的去垢劑如SDS、Trixton等可以快速高效地提取樣本的蛋白質，然而由于這些去垢劑與色譜不相容，因此本研究采用了對分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法對棉花多肽進行提取。孫婷婷等利用尿素法，基于Nano LC-MS/MS在水稻葉片和根部共鑒別出約110個多肽，通過功能分析發現，這些多肽參與了水稻重要的生理活動[13]。在本研究中，筆者在提取液中加入了蛋白酶抑制劑，首先減少了內源降解的干擾，其次使得提取過程保持在低溫環境下進行，另外，提取過程中的無機鹽提取劑在最后的除鹽步驟中被去除，極大地提高了植物多肽組的提取純度和效率。通過高分辨率的質譜檢測和數據整理，筆者發現這種方法的提取效果較好，在棉花根部組織中鑒定出809個多肽。

通過對這些多肽的前體蛋白功能進行功能注釋后發現，它們參與到細胞組成、 分子調控和生物代謝各個方面。例如筆者發現，病程相關蛋白來源的多肽可以調控植物的脅迫反應。病程相關蛋白是植物在受到生物、非生物脅迫后產生的一種小分子蛋白，具有廣泛的功能，可以硬化細胞壁、傳導信號以及抗菌等[14]。前人研究發現，病程相關蛋白10在參與植物的生長發育、次生代謝及應對外界生物和非生物脅迫時發揮著重要的作用[15]。在對棉花的研究中發現，黃萎病病菌侵染可以誘導PR10蛋白的表達[16-17]。轉化煙草、擬南芥的試驗結果表明，PR10可以提高植株對黃萎病病菌的抗性，并且能提高植物抗菌素黃酮類化合物的水平。此外，PR10的表達也能改變煙草、擬南芥的表型，如轉基因植株生長延緩、轉基因擬南芥葉片傾向于橫向生長而呈近圓形、頂端優勢減弱、側生莖數量顯著增多等現象，證實PR10也參與調控植物的生長發育[18]。盡管PR10的部分重要功能已被鑒定，然而其調控機制到目前為止還不清晰。在本研究中，筆者通過質譜分析發現，PR10可以產生多個不同修飾的多肽分子，因此推測PR10可能通過不同的多肽去調控不同的生長并應對環境脅迫反應。在后續研究中，筆者將聚焦這些重要多肽進行功能驗證。

植物天然多肽組的提取是植物多肽組學發展的一切基礎。通過探索高效的多肽分離方法，可以挖掘植物體中的天然活性多肽，后續將其作為生長調節劑或者抗菌藥劑人工合成應用于生產，對于棉花增產抗病具有重要的理論與實踐意義。

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