摘要：本文采集化工廠附近被污染土壤，經過富集培養、初篩和復篩，得到一株產耐有機溶劑β-葡萄糖苷酶的革蘭氏陽性菌株，并命名為ZXS，經鑒定該菌為Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）。該菌在溫度35 ℃，pH為7.0，DMF含量10%的條件下，β-葡萄糖苷酶活力最高，可達24.7 U/L。
關鍵詞：耐有機溶劑；糖苷酶；篩選；鑒定
中圖分類號：Q556+.2 文獻標識碼：A 文章編號：1003-2177（2018）02-0093-04
糖苷酶（Glycoside hydrolases， GH， EC 3.2.1），又稱糖苷水解酶，廣泛存在于生物體中[1-2]，在自然界糖苷鍵的水解過程中扮演著非常重要的角色。糖苷酶作為一類重要的化合物，在食品、醫療、工業等領域都有著十分廣泛的利用價值[3-7]。但目前已知存在的糖苷酶大多數都存在酶活力低的問題，且該酶來源十分匱乏。因此，尋找天然產耐有機溶劑糖苷酶的微生物顯得尤為重要。本實驗采用含有機溶劑的培養基，篩選能產耐有機溶劑糖苷酶的微生物，并對所得微生物進行生物學鑒定，優化產酶條件，為進一步的研究和應用提供酶源和基礎數據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要設備與材料
臺式高速冷凍離心機，德國希格瑪離心機有限公司，singma3K15型；PCR自動系列化分析儀，德國耶拿分析儀，Tpersonal型；瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠，DYCP-32A型。
浙江臺州路橋某家化工企業所排污水長期污染過的土樣。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、對硝基苯酚-p-D-葡萄糖苷、HEPES。
1.1.2 培養基
富集培養基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0 g/L，DMF 5%，胰蛋白胨25.0 g/L，酵母提取物3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素液100 mL/L（MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.005 g，CaCl2 0.005g，溶于100 ml蒸餾水中），pH 7.0。
初篩培養基：將富集培養基中的胰蛋白胨替換成 （NH4）2SO4 5.0 g/L。
復篩液體培養基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，DMF 5%，（NH4）2SO4 5.0 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 3 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，微量元素溶液100 mL/L，pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 富集培養
將采集的土壤懸浮在裝有90 mL已滅菌的生理鹽水的錐形瓶中，在180 r/min，30 ℃條件下的搖床中震蕩30 min，取部分菌液轉移到富集液體培養基進行培養，然后重復轉接2次。
1.2.2 初篩
選擇有明顯的微生物生長的富集培養液，取部分富集培養液涂布于初篩固體培養基上，30 ℃恒溫箱中培養24 h，觀察平板上微生物生長情況。
1.2.3 復篩及酶活測定
從初篩培養基中挑取明顯生長的單菌落于復篩液體培養基中培養，然后取菌懸液離心收集菌體，再用等體積的50 mM HPPES（pH7.0）緩沖液重懸，制得菌懸液，以對硝基苯酚葡萄糖苷為底物，測其糖苷酶活力大小。
1.2.4 菌種鑒定
分離純化菌種，觀察純種菌種的菌落形態，包括菌落大小，顏色，濕度，邊緣等；用革蘭氏染色，用顯微鏡觀察細菌形態；根據試劑盒提取基因組DNA，然后進行PCR擴增（50μl的體系：去離子水21μl，PrimeSTAR MAX Premix 25 μl，基因組1μl，引物pF-rRNA和pR-rRNA各1.5 μl），瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。接著對PCR產物割膠回收，利用割膠回收試劑盒純化基因組以及回收基因組。最后，進行測序，在基因庫進行比對，制作進化樹。
2 實驗結果與分析
2.1 微生物鑒定
2.1.1 形態鑒定
對微生物進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察其染色情況以及形態，實驗結果如圖1所示，微生物革蘭氏染色呈紫色，所以該微生物屬于革蘭氏陽性菌，并且微生物的形態呈桿狀，桿狀比較短，屬于短桿菌類。
2.1.2 分子生物學鑒定
通過提取基因組，再進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后進行割膠回收純化基因，并將片段收回用于測序。經過序列比對，得出該微生物的生長進化樹如圖2所示。經過序列比對得出該微生物與Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）一類序列最為接近。
2.2 微生物產酶性質研究
2.2.1 反應溫度對酶活力的影響
對于反應溫度進行優化，分別考察了20、25、30、35、37、40 ℃條件下微生物ZXS的產酶活力，每個條件都進行3次平行重復試驗。結果如圖3（A）所示，隨著反應溫度的不斷升高，該酶活力先升高達到最大值后再降低，其中在溫度為35 ℃時產酶效果最佳。
2.2.2 反應體系pH值對酶活力的影響
對于反應體系中的pH進行優化，分別在pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下進行考察，每個條件進行3次平行重復試驗，再檢測微生物ZXS的產酶活力。結果如圖3（B）所示，隨著pH的變化酶活力也在不斷地變化，總體趨勢是隨著pH的不斷增大，酶活力呈現上升趨勢，其中pH為7.0和10.0時酶活力達到最高，接近相等，所以該菌株在一定程度上具有耐受堿性能力，并且在pH 5.0～10.0之間時，此酶的催化活力都相對較穩定。
2.2.3 DMF濃度對酶活力的影響
對于反應體系中有機溶劑試劑DMF的含量進行考察，分別選取了不含DMF試劑，含5%、10%、15%、20%DMF的反應體系進行反應，每個條件進行3次平行重復試驗，再檢測微生物ZXS的產酶活力。結果如圖3（C）所示，隨著DMF濃度的升高，菌株的產酶性能逐漸減弱，但并沒有完全抑制酶活力，所以總體上DMF對該酶的酶活力有一定的抑制作用。
2.2.4 不同有機溶劑對酶活力的影響
對于微生物ZXS的耐有機溶劑性能進行考察，在反應體系中分別含有10%的DMF、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇的條件下進行催化反應，每個條件進行3次重復試驗，再檢測微生物ZXS的產酶活力。結果如圖3（D）所示，該菌株在相同條件下對二甲基亞砜的耐受力更好，對無水乙醇的耐受力最差。
3 結語
本實驗篩選得到1株產耐有機溶劑糖苷酶的微生物，命名為ZXS，屬于Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）類革蘭氏陽性菌株。該菌株在無有機溶劑的情況下酶活最高達到40.2U/L。經進一步對其產酶條件的優化，菌株培養8h后，在反應溫度為35℃，pH為7.0，DMF含量為5%時，酶活力最高達到25.9U/L。
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