【關(guān)鍵詞】 沙門氏菌；檢測

doi：103969/jissn1004-7484（s）201306736 文章編號(hào)：1004-7484（2013）-06-3418-02

沙門氏菌因美國病理學(xué)家DE沙門于1884年發(fā)現(xiàn)本屬菌中的豬霍亂桿菌而得名。本屬菌是一群抗原構(gòu)造和生物學(xué)性狀相似的革蘭氏陰性桿菌。菌型繁多，已發(fā)現(xiàn)有2000種以上的血清型，我國已發(fā)現(xiàn)216個(gè)[1]。引起人類疾病的沙門氏菌大多屬于A、B、C、D、E，5個(gè)血清群，病型有①傷寒與副傷寒（統(tǒng)稱腸熱癥）：由傷寒沙門氏菌、甲型和乙型副傷寒沙門氏菌等引起；②食物中毒：可由不同菌型引起，以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌等最為常見；③敗血癥：由豬霍亂沙門氏菌等引起，此外，還可引起慢性腸炎。人感染沙門氏菌后，可呈無癥狀帶菌，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。為了有效預(yù)防沙門氏菌病，人們在探索沙門氏菌檢測方法的過程中，做出了不懈的努力，特別是在免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方面，開發(fā)各種新型快速檢測技術(shù)，提高了沙門氏菌檢測的速度和質(zhì)量，有效預(yù)防和控制沙門氏菌的傳染。由于其樣品來源極為繁雜，盡管各國學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了長期研究，仍存在不少問題。將有關(guān)檢測進(jìn)展綜述如下：

1 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法[2]

所有患者均在知情同意情況下進(jìn)行腹水細(xì)菌陽性培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)，抽取患者腹水時(shí)嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，并將腹水接種到裝有葡萄糖肉湯的培養(yǎng)試管中。對(duì)于培養(yǎng)結(jié)果為陽性的患者應(yīng)轉(zhuǎn)種到慷慨平板及血平板中，并將單個(gè)菌落分離鑒定。應(yīng)用MIC法對(duì)革蘭氏陽性菌及陰性菌進(jìn)行鑒定。革蘭氏陽性菌患者采用GP法鑒定進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，革蘭氏陰性菌患者應(yīng)用GN021法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)[2]。上述所有操作必需嚴(yán)格按照無菌操作以及試劑盒說明書進(jìn)行。

2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是以抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細(xì)菌，通過病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白（抗體）的方法。

21 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)上世紀(jì)80年代，隨著單克隆抗體技術(shù)問世并日益成熟，抗沙門氏菌各種O抗原、H抗原單抗都隨之建立起來，并取代了常規(guī)因子血清進(jìn)行血清學(xué)鑒定、傷寒診斷，顯示出單抗的優(yōu)越性能。目前正在研制腸炎沙門氏菌特異性單克隆抗體Hgm，兩株單抗聯(lián)合使用將會(huì)更準(zhǔn)確地檢測腸炎沙門氏菌。文其乙等人在前人基礎(chǔ)上應(yīng)用沙門氏菌屬特異性單克隆抗體CB8和de7建立了檢測沙門氏菌的直接ELISA方法，并形成了快速檢測試劑盒[3]。

22 斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附（Dot-ELISA）試驗(yàn)是一項(xiàng)免疫學(xué)檢測技術(shù)。桑杰等以硝酸纖維膜為固相載體，利用沙門氏菌多價(jià)血清和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記制備的羊抗兔IgG，成功地建立對(duì)香腸的Dot-ELISA檢查法，同時(shí)，采用常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)作為對(duì)照試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在86份香腸中，用Dot-ELISA檢出沙門氏菌陽性為36份，陽性率為4186%；而常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)檢出沙門氏菌陽性為34份，陽性率為3952%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，t=0311，P﹥005，兩種方法差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。

23 全自動(dòng)熒光酶標(biāo)免疫快速篩選法（mini-VIDAS快速篩選法）Mini-VIDAS快速篩選法是一套全自動(dòng)食品致病菌檢測方案。沙門氏菌的抗原鑒別是基于在VIDAS儀器內(nèi)進(jìn)行的酶聯(lián)熒光免疫分析。沸煮一定的增菌肉湯，加入試劑條內(nèi)，肉湯中的混合物在特定的時(shí)間內(nèi)循環(huán)于SPR內(nèi)外。沙門氏菌抗原存在則與包被在SPR內(nèi)的單克隆抗體結(jié)合，堿性磷酸酶的抗體在SPR內(nèi)外循環(huán)與結(jié)合在SPR內(nèi)壁上的沙門氏菌抗原結(jié)合。廢物-4-甲基傘形磷酸酮被SPR壁上的酶轉(zhuǎn)化成熒光物-4甲基傘形酮。熒光強(qiáng)度由光學(xué)掃描器測定。試驗(yàn)結(jié)果由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析。產(chǎn)生基于熒光測試的試驗(yàn)值與標(biāo)準(zhǔn)比較后打印出每一個(gè)被測樣品的陽性或陰性結(jié)果報(bào)告。利用此方法進(jìn)行沙門氏菌檢測，只要增菌培養(yǎng)基，不需純培養(yǎng)，增菌——上機(jī)后49h即可檢測出結(jié)果。具有省時(shí)、方便、靈敏、假陽性少等特點(diǎn)[5]。

3 分子生物學(xué)方法

31 分離培養(yǎng) ①取對(duì)數(shù)生長的沙門氏菌細(xì)胞，經(jīng)消化后接種在預(yù)先放置蓋有玻片的6孔板中；②待細(xì)胞生長成單層后將蓋玻片取出，并采用PBS將細(xì)胞洗滌3次；③采用4%的多聚甲醛在4℃的溫度下進(jìn)行固定，并采用PBS溶液將細(xì)胞進(jìn)行洗滌3次；④并在通透細(xì)胞膜中加入5%的Triton溶液浸泡15min，并采用PBS洗滌3次；⑤采用甲醇溶液將內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行封閉，并于室溫20℃采用PBS溶液將樣本洗滌3次；⑥將含有二抗的正常動(dòng)物血清放濕盒進(jìn)行封閉，并于室溫下20℃進(jìn)行放置；⑦將懸浮液中加入羊抗人β波形蛋白單克隆抗體，并在37℃溫度中將樣本進(jìn)行孵育2小時(shí)，并在4℃的冰箱中放置保存；⑧往樣本溶液中加入生物素化二抗，并在室溫下孵育15min，同時(shí)采用PBS溶液洗滌3次；⑨往樣本溶液中加入過氧化物酶標(biāo)鏈霉素，并在室溫下孵育15min，同時(shí)采用PBS溶液洗滌3次；⑩往樣本溶液中加入DBA顯示劑對(duì)樣本進(jìn)行顯色；○11采用自來水對(duì)樣本進(jìn)行洗滌，并采用蘇木素對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染，進(jìn)行封片，并在顯微鏡下觀察樣本細(xì)胞的情況。

32 轉(zhuǎn)染 ①在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞消化并分別接種在6個(gè)孔板中，同時(shí)在濃度為5%的CO2溶液中將其孵化道培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔板約60%-80%時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)染；②轉(zhuǎn)染方法按照生廠商提供實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作；③將含有陰性熒光的Notch1100pmol中的Notch1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后與含有5ug的脂質(zhì)體的Notch1進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)，并靜置20min后將其制備為轉(zhuǎn)染復(fù)合物；④將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中，并加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基將每個(gè)孔的體積調(diào)至2000uL；⑤將樣本溶液置于含有CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵化培養(yǎng)5-7h后，更換含有10%的胎牛血清以及雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24h；⑥在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染的情況，并根據(jù)轉(zhuǎn)染率=熒光視野細(xì)胞數(shù)/明視野細(xì)胞數(shù)x100%，從而計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率；⑦beta-catenin Notch1轉(zhuǎn)染方法同上。

33 總RNA的提取 總RNA的提取方法如下：①當(dāng)孔板長滿細(xì)胞至85%-95%時(shí)，將上清液去除，并采用PBS將上清液漂洗2次；②在每孔中加入1mLTrizol試劑，并對(duì)樣液進(jìn)行搖勻，同時(shí)在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行消化3-5min，直接細(xì)胞脫壁，樣液粘稠為止；③在每個(gè)孔中將消化好的細(xì)胞裂解液吸收到處理過的15mL的EP試管中，并加入氯仿02mL，對(duì)樣品液輕搖至15s；④將樣本溶液于室溫下靜置3min后，將樣本溶液置于4℃中進(jìn)行離心15min；⑤取上清液置新的EP管中，并加入05mL的異丙醇，同時(shí)在室溫下靜置10min；⑥將樣本溶液進(jìn)行離心10min，直至見到RNA沉淀于EP管底內(nèi)部；⑦將上清液棄置，并采用75%的乙醇將樣本溶液進(jìn)行洗滌，并在4℃中進(jìn)行離心15min；⑧將上清液棄置，采用小Tip吸干液體，將沉淀物風(fēng)干，并加入CEPC處理水，吹打均勻，并在水浴中將RNA溶解，測定OD值。

34 逆轉(zhuǎn)錄 按照RT試劑盒的操作經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，具體方法如下：①準(zhǔn)備EP試管065mL。②冰上操作：往EP管中加入10uL的DEPC水，1uL的引物，總RNA含量為1UL，并進(jìn)行短暫離心。③將樣本置于65℃的水浴中加熱5min，并立刻置于冰上。④反應(yīng)體系：含有4uL的5x RT Buffer，1uL RNA，2uL的10mMdNTP，10uL RNase free H2O，1uL 濃度為10U/uL的Rnase inhibitor，1uL的ReverTra Ace，總體系溶液為20uL。⑤反應(yīng)條件：在42℃中反應(yīng)20min；95℃中反應(yīng)5min，在4℃中反應(yīng)5min。⑥將樣本置于cDNA在溫度為﹣20℃中進(jìn)行保存。

35 將變性蛋白樣品進(jìn)行SDS﹣PAGE電泳 ①清洗玻璃板；②灌膠：將凝膠充分聚合后，拔出加樣孔；③加入適量電泳緩沖液，并提取蛋白樣本100ug，小心加入樣孔中；④濃縮凝膠以60V進(jìn)行電泳30min，分離膠則以100V進(jìn)行電泳90min，并以蛋白marker條帶進(jìn)行分開，采用溴酚藍(lán)結(jié)束電泳時(shí)間；⑤轉(zhuǎn)膜：取與凝膠面積大小相當(dāng)?shù)拇姿崂w維膜用甲醛進(jìn)行浸泡5min，并置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中制備備用，按照3層濾紙，按照醋酸纖維素濾膜、凝膠、3層濾紙的順序逐張進(jìn)行疊放，在凝膠上面合上夾子，講氣泡趕走，并將其置于預(yù)冷轉(zhuǎn)膜槽中，給予足量的轉(zhuǎn)膜緩沖溶液，并以200mA的電流進(jìn)行電泳；⑥免疫反應(yīng)：采用TBST膜置于5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，并在溫室搖床中搖勻1小時(shí)。分別加入beta-catinen、MMP﹣9單克隆抗體，并在4℃中孵化過夜，并在常溫下對(duì)樣本進(jìn)行脫色，置于搖床中進(jìn)行搖勻，并采用TBST進(jìn)行洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為10min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)鼠抗羊二抗，并在室溫下孵育1小時(shí)，置于搖床中進(jìn)行搖勻，并采用TBST進(jìn)行洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為10min；⑦曝光處理：采用ECL發(fā)光試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行化學(xué)熒光反應(yīng)，并在暗室環(huán)境中壓片5min，加入顯影液，定影液3min；將膠片進(jìn)行拍照及掃描，凈光密度值采用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

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