摘要：對一例病豬進行了流行病學調查和實驗室檢查，結合血清學和聚合酶鏈式反應（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ）方法進行病例檢測，結果表明，該例病豬是由弓形蟲（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ Ｎｉｃｏｌｌｅ ＆ Ｍａｎｃｅａｕｘ）感染引起。

關鍵詞：豬；弓形蟲??；聚合酶鏈式反應；診斷

中圖分類號：Ｓ８５８．２８；Ｓ８５１．３１＋３；Ｓ８５２．７２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）04－0796-04

Clinic Report for Diagnoses of Swine Toxoplasmosis

ＬＩＵ Ｔａｏ，ＷＡＮＧ Ｒｕｉ，ＱＵ Ｚｈｅ－ｈｕｉ，ＷＥＩ Ａｉ－ｚｈｉ，ＺＨＡＮＧ Ｌｉｎｇ

（Ｘｉｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎ ｏｎｅ ｃａｓｅ ｏｆ ｐｉｇ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＰＣＲ （Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ） ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ was ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｓｗｉｎｅ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ （Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ Ｎｉｃｏｌｌｅ ＆ Ｍａｎｃｅａｕｘ）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｗｉｎｅ； tｏｘｏｐｌａｓｍosis； ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｄｉａｇｎｏｓｉｓ

弓形體又叫弓形蟲、弓漿蟲或毒漿蟲（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ Ｎｉｃｏｌｌｅ ＆ Ｍａｎｃｅａｕｘ），屬于一種單細胞原蟲，是引發弓形蟲病的病原體。病原體寄生在終末宿主貓科動物體內生長繁殖，形成卵囊并隨宿主糞便排出體外，發育成熟而具有感染力。具有感染力的卵囊污染食物和水源，被中間宿主（人或豬等多種動物）食入或飲入后，經淋巴和血液進入組織器官，并侵入有核細胞內，造成組織器官的嚴重損害和機體免疫力下降，而出現患病體征。據相關統計資料表明，一般豬場豬群感染率在２０％以上，有的高達６０％，死亡率達６０％～８０％。弓形蟲病一年四季均可發生，但以每年的４～１０月多發，任何年齡的豬都可感染，而以１０～５０ ｋｇ的中小豬發病較嚴重。臨床上生產母豬（包括后備母豬）常有發病，但配種公豬很少發生，這可能與抵抗力有關［1-3］。高床飼養的豬群少見發病，而平養的豬群則屢見不鮮，可能與豬只接觸糞便的程度有關。河南省信陽市平橋區某商品豬場養豬３ ０００多頭，２０１０年４～５月期間豬群突然發病，在１個月內陸續死亡５頭，２０多頭病危，另有１００多頭發病。發病和死亡的豬以４０～５０ ｋｇ的中小豬為主。作者主要就這起豬弓形蟲病的流行特點、臨床癥狀、診斷方法以及防治處理等方面做如下報告。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試驗動物１頭發病死亡的育肥豬；６頭活豬，有育肥豬４頭、母豬１頭和空懷母豬１頭，從６頭活豬頸靜脈隨機無菌采集全血，每頭約４ ｍＬ，得到血液樣品。

１．１．２檢測試劑Ｔａｑ酶、ＰＣＲ緩沖液（含Ｍｇ２＋）、ｄＮＴＰ為大連寶生物公司產品；蛋白酶Ｋ為Ｍｅｒｃｋ公司產品；弓形蟲抗原ＥＬＩＳＡ檢測試劑盒購自武漢科前生物技術有限公司；小白鼠購自信陽職業技術學院。染色液有瑞氏染液、ＨＥ染液。

１．１．３引物設計根據ＧｅｎＢａｎｋ中已登錄的豬弓形體基因序列（ＡＦ１４６５２７），利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０軟件設計一對引物，上游引物Ｐ１為５′－ＣＧＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧ－３′；下游引物Ｐ２為５′－ＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴ－３′。預計ＰＣＲ擴增產物長度為４６３ｂｐ。

１．１．４主要儀器為實驗室現有的ＰＣＲ儀（美國ＡＢ公司）、高速冷凍離心機（Ｓｉｇｍａ公司）、尼康Ｅ２００顯微鏡、尼康４５００數碼照相機。

１．２獸醫檢查

１．２．１涂片對發病死亡的育肥豬進行剖檢，剖檢時，取病死豬的血液、心包液和腹腔液進行涂片，用瑞氏染色法染色后光學顯微鏡檢查，進行流行病學調查。

１．２．２病理學檢查按常規方法對發病死亡的育肥豬進行尸體剖檢，記錄眼觀病變情況。

１．２．３血清學檢測將采集到的４頭育肥豬的全血在高速冷凍離心機上５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心８ ｍｉｎ，分離血清。采用豬弓形蟲酶聯免疫吸附試驗（ＥＬＩＳＡ）進行檢測。

１．３ＰＣＲ檢測

剖解時無菌分別取一塊肺臟、肝臟、淋巴結以及脾臟組織，放入無菌塑料袋中，于－７０℃環境備用。

１．３．１ＤＮＡ的提取取病料肺、肝、淋巴結組織研碎，后加１０倍生理鹽水接種小白鼠腹腔，每只接種０．５ ｍＬ。待小白鼠出現被毛粗亂、呼吸促迫癥狀，從其腹水收取弓形蟲速殖子，計數后加入ＳＤＳ裂解液和蛋白酶Ｋ，混勻后置于３７℃消化過夜。消化好的蟲體懸浮液再加入５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液和５％ ＣＴＡＢ溶液，６５℃水浴１０ ｍｉｎ；苯酚∶氯仿∶異戊醇（２５∶２４∶１）溶液抽提２次，用異丙醇沉淀，７０％乙醇洗滌；適量的滅菌水溶解，－２０℃保存。

１．３．２ＰＣＲ反應ＰＣＲ反應體系為５０ μＬ，ＤＮＡ模板添加量為０．５ μｇ。ＰＣＲ反應程序為９４℃預變性５ ｍｉｎ；９４℃變性３０ ｓ，５３℃退火３０ ｓ，７２℃延伸３０ ｓ，３５個循環；最后７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物經１２ ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳觀察結果［4-7］。選取其中一陽性樣品的４６３ ｂｐ左右的ＰＣＲ擴增產物片段，用ＴａＫａＲａ公司的ＤＮＡ片段瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與Ｔ－Ｅａｓｙ載體（Ｐｒｏｍｅｇａ）連接，轉化Escherichia coli ＪＭ１０９感受態細胞，篩選陽性重組質粒，送上海生工生物技術服務有限責任公司測序。

２結果與分析

２．１臨床癥狀

患豬突然減食或廢食?；舾邿?，體溫常達４１．５～４２．０℃或更高，并稽留不退，一般持續５～１０ ｄ或更長?？人?，有明顯的呼吸癥狀，常呈腹式呼吸。腹瀉，鼻、耳、四肢及股內外側、胸腹部、臀背部等處皮膚出現紫紅色出血點或由出血點融合而成的瘀血斑塊，甚至有的遍及全身而遍體紫紅（圖１）。

２．２病理變化

體表瘀血發紺或有壞死結痂斑塊；胸腔、腹腔出現積液，色淺黃；肺、脾、肝等實質器官具有特征性病變，肺膨大（水腫），被膜緊張有光澤，表面可見大小不等的紫紅色壞死病灶，小葉間質明顯增寬（圖２）；脾腫大，表面有灰白色壞死點，脾髓如泥；肝腫脹渾濁，表面和切面可見灰白色壞死病灶（圖３）。全身淋巴結顯著腫大，特別是頜下、肺門、肝門等處淋巴結比正常的大２～３倍。胃黏膜潮紅，腸道明顯充血，腸黏膜可見多量壞死病灶，腸系膜淋巴呈繩索樣腫大（圖４）。

２．３涂片觀察

血液涂片用瑞氏液染色，鏡檢發現月牙形滋養體，核為紅色，細胞質為藍色（圖５）。

２．４血清學診斷

試驗設豬弓形蟲血清抗體大于０．４９４判為陽性，小于０．４２２判為陰性，在０．４２２～０．４９４之間為可疑。得到的豬弓形蟲血清抗體ＥＬＩＳＡ檢測結果分別是育肥豬１號０．９３６、育肥豬２號０．８６７、育肥豬３號０．９２７、育肥豬４號０．８３１、母豬０．９２２、空懷母豬０．９１０，由此可見，所檢測樣品的抗體均為陽性。

２．５ＰＣＲ結果

剖檢豬所采樣品出現了與預期大小一致的目的條帶，且為陽性（圖６）。

２．６ＰＣＲ產物的克隆和序列測定

測序分析結果表明，克隆的基因片段長度為４６３ ｂｐ，核苷酸序列經測定提交后證實，所克隆的基因為豬弓形蟲的部分基因，其核苷酸序列為：ＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＧＧＡＴＧＡＧＡＣ

ＣＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＴ

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ＣＡＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧ。

３討論

３．１診斷

根據ＰＣＲ和血清學檢測結果為陽性，可以判定該次疫情是由弓形蟲感染引起的。依據其臨床癥狀和病理變化特點，該起豬弓形蟲病為急性感染。

３．２豬弓形蟲病與豬瘟在臨床上的鑒別診斷

豬弓形蟲病在臨床表現上，有些癥狀與豬瘟頗為相似，這常常導致誤診。其實，豬弓形蟲病與豬瘟在臨床上的表現雖然相似，但卻不盡相同，只要仔細觀察，是不難分辨的，總結我們的臨床經驗，可從下面幾點進行鑒別。

３．２．１體表出血（瘀血）斑點不同豬瘟的體表皮膚出血僅發生于耳尖、四肢內側、腹下等皮薄處，而豬弓形蟲病的出血點或瘀血斑塊則全身到處可見，特別是在胸背部、薦臀部等皮膚厚實的部位出現，這是豬瘟患豬所少見的。豬瘟出血是局限性、散在性的出血點（如火雞蛋或麻雀蛋樣），即使融合也不會形成大斑塊，程度較輕微；而豬弓形蟲病患豬的出血則呈廣泛性、彌漫性的瘀血斑塊，甚至有的瘀血斑塊互相融合遍及全身。豬瘟體表出血斑點呈紫黑色或藍黑色，顏色較深；豬弓形蟲病患豬體表瘀血斑塊多呈紫紅色，顏色相對較淺。

３．２．２排泄物不同豬瘟便秘階段排出的粒狀干硬糞團呈灰黑或灰褐色，后期拉稀呈黃褐色水樣腹瀉，尿液淺黃色；而豬弓形蟲病患豬排的粒狀干硬糞團呈暗紅色，后期拉稀呈醬油（煤焦油）樣半流體黏稠糞便。尿液呈鮮橘黃色。

３．２．３體溫不同豬瘟病豬雖體溫升高，但高熱稽留時間相對較短，常于高熱后不久就下降到４０．５℃，而持續低燒不退；豬弓形蟲病患豬的高熱稽留時間較長，４１．５℃以上高熱可稽留７～１０ ｄ或更長時間。

3．２．４病理變化不同典型臨床癥狀的豬瘟雖已不多見，但解剖病變仍具有特征性，即以全身性出血為主，如皮下組織和實質器官表面的針頭狀散在性出血，以及全身淋巴結腫大出血，淋巴結切面紅白相間（大理石樣）；而弓形蟲病豬內臟器官則以出現大量的壞死病灶為特點，雖然全身淋巴結腫大，但卻沒有周邊出血和切面紅（黑）白相間的病理變化。

３．２．５發病季節不同兩者雖一年四季均可發生，但豬瘟多發生于寒冷季節（深秋、冬季和初春）；弓形蟲病病原體（卵囊）需要一定的溫度和濕度條件才能發育成熟而具備感染力，所以多在高溫高濕季節（４～１０月）出現。

３．３預防措施

豬弓形蟲病一旦在豬場發生，病原很難清除，將會在場內經久不息，必須采取綜合措施，全面防范，否則后患無窮。貓是弓形蟲的終末宿主，是傳播本病的罪魁禍首，豬場內應禁止養貓和防止野貓進入（毒餌誘殺或人工捕殺）；定期滅鼠，加強飼料及原料的保管貯存，避免貓鼠進入飼料倉庫，禁止使用被貓、鼠糞尿污染的飼料喂豬；定期全場消毒，清除糞污，減少環境中的病原數量和傳播機會；定期在飼料中添加磺胺類藥物，新出現病例的豬場或曾發生過豬弓形蟲病的豬場，添加藥物混飼進行群體預防尤為必要。應于發現確診病例之后或于每年４月氣溫回升之時實行全場加藥，實施群體預防；在添加磺胺類藥物時，應按常規比例添加磺胺增效劑；為減少磺胺類藥物對豬體腎臟的毒害及副作用，還應同時添加小蘇打［8］。

３．４治療

豬弓形蟲病病原對磺胺類藥物敏感，早期和足夠療程治療，療效相當確切，應在發現病例后盡快做出確診并立即用藥，以阻止病原體在病豬體內的繁殖和減少對機體的危害。常用的藥物是磺胺六甲（磺胺間甲氧嘧啶）、磺胺五甲（磺胺對甲氧嘧啶）和增效磺胺嘧啶鈉注射液（可按７５ ｍＬ／ｋｇ肌注，首劑加倍），這些藥物每天２次，連用２ ｄ后，再以同樣劑量每天用藥１次，繼續連用３～５ ｄ［8］，一般都會康復。

參考文獻：

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