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【摘要】 目的：探討RhoE與EGFR在食管鱗狀細胞癌中的表達及相關性，并分析其臨床意義。方法：收集2011年1月-2012年1月本院的食管鱗狀細胞癌癌組織及相應的癌旁組織59例，運用RT-PCR方法對進行檢測，測定RhoE與EGFR的表達情況，結合患者其他指標運用統計學方法進行分析。結果：（1）在食管鱗癌和正常的食管組織中，EGFR相對的表達量分別是（0.581±0.174）、（0.347±0.136），差異有統計學意義（P<0.05）。（2）RhoE在食管鱗癌組織中的相對表達量是（0.346±0.241），在正常食管組織中相對的表達量為（0.673±0.142），差異有統計學意義（P<0.05）。（3）兩者在食管鱗癌組織中的表達水平與腫瘤的病理分期、分化程度的高低、淋巴有否轉移以及腫瘤浸潤情況都有著密切關系（P<0.001），但是與其他因素諸如腫瘤分型、大小和部位無關（P>0.05）。（4）RhoE與EGFR在食管鱗癌組織中的表達呈負相關（P<0.01）。結論：EGFR與RhoE兩者在食管鱗癌中的表達呈負相關，EGFR基因的表達水平是增高的，而RhoE的表達的水平是降低的；兩者的表達水平與腫瘤的病理分期、分化程度的高低、淋巴有否轉移以及腫瘤浸潤情況等多種生物學行為密切相關，由此可以看出，兩者的表達水平在食管鱗癌的發生、發展中起著至關重要的作用；檢測食管鱗癌組織中兩者的表達情況有助于評估其預后。
【關鍵詞】 食管鱗癌； EGFR； RhoE； RT-PCR
【Abstract】 Objective：To explore the expression and correlation of RhoE and EGFR in esophageal squamous cell carcinoma， and analyze its clinical significance.Method：59 patients with esophageal carcinoma were collect from the in our hospital from Jan 2011 to Jan 2012. The method of RT-PCR was used to examine the expressions of RhoE and EGFR in esophageal carcinoma and normal esophageal tissues. The results and other relevant clinical parameters were used for statistical analysis.Result：（1）The relative expression of EGFR in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal tissues were （0.581±0.174） and （0.347±0.136），the difference between them was significant （P<0.05）.（2）The relative expression of RhoE in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal tissues were （0.346±0.241） and （0.673±0.142）， the difference between them was significant （P<0.05）.（3）The expressions of them were closely related to expression of tumor pathological staging， differentiation degree， lymph metastasis and high tumor infiltration （P<0.001），but had no relationship with other factors such as tumor type， size and location（P<0.01）.（4）It had a negative correlation between the expression of RhoE and EGFR in esophageal squamous cell carcinoma （P<0.01）.Conclusion：The expression level of EGFR gene in esophageal squamous cell carcinoma is higher， while the RhoE expression level is lower； it has a negative correlation between them. The expressions of them have a closely relationship with the expression of tumor pathological staging， differentiation degree， lymph metastasis and high tumor infiltration.Thus，it can be seen that，the expressions of RhoE and EGFR plays a vital role in the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma. Testing the expressions of esophageal squamous cell carcinoma tissue will help us to evaluate the prognosis.
【Key words】 Esophageal squamous cell carcinoma； EGFR； RhoE； Reversetranscription PCR
我省是食管癌的高發區，研究表明，EGFR和RhoE均作用于Ras信號通路，并且兩者在腫瘤的發生發展中可能分別扮演者癌基因和抑癌基因的角色。有研究發現，在食管鱗狀細胞癌體外癌細胞中，RhoE基因的上調可以細胞周期阻滯于G0/G1期，降低癌細胞的侵襲性，促進癌細胞的凋亡[1]。本研究通過RT-PCR方法檢測食管鱗狀細胞癌中RhoE與EGFR的表達情況，并結合臨床其他資料運用統計學方法進行分析，分析兩者之間的相關性及其與食管鱗癌的惡性程度及轉移情況的關系。為食管鱗狀細胞癌的診斷及預后提供新的依據，并為食管鱗狀細胞癌的治療提供新的方向。
1 材料與方法
1.1 材料 本組59例，取材2011年1月-2012年1月本院胸心外科手術切除的食管鱗癌標本為癌癥組，同一患者癌旁>5 cm的正常組織為對照組，其中男35例，女24例，年齡48～79歲，平均（53.85±6.36）歲；按照2003版國際抗癌聯盟UICC標準分期：I期1例，Ⅱ期28例，Ⅲ期27例，Ⅳ期3例；分化程度按高、中、低分化分別為12、34、13例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移41例。大體分型：髓質型31例、蕈傘型8例、潰瘍型8例、縮窄型6例。所有病例術前均未行化療、放療、免疫或生物治療，并且均有完整臨床資料以及病理診斷。
1.2 主要試劑 DAB顯色劑、TrizolRNA提取液試劑盒、目的基因引物、β-actin基因引物購自上海生基生物科技有限公司，DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 逆轉錄-聚合酶鏈反應（reversetranscription PCR，RT-PCR）
1.3.1.1 RNA的提取 標本研磨后，用TaKaRa公司的Trizol試劑和氯仿提取RNA，經異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，室溫干燥后加30 μL的DEPC進行沉淀。取2 μL進行1%瓊脂糖凝膠測定，另取2 μL稀釋50倍后紫外測OD 260的吸光度，其余進行cDNA合成。
1.3.1.2 cDNA合成 根據M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）使用說明：上述提取的RNA 4 μL（約1 μg），Oligo（dT）（5 μM）1 μL，RNase free dH2O至6 μL，70 ℃保溫10 min，冰上急冷2 min，離心數秒使模版RNA/引物的變性溶液聚集與EP管底部。在上述EP管中再加入2μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP mix（各10 mM），0.25 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），0.5 μL RTase M-MLV（RNaseH-）加RNase free dH2O至10 μL，42 ℃，1 h。70 ℃，保溫15 min后冰上冷卻，得到的cDNA保存-20 ℃，并直接用于下一步PCR擴增。
1.3.1.3 目的條帶擴增 參照試劑盒上的說明，按照表1數據配制PCR反應液。加入后，充分混勻，按表2條件進行PCR擴增。
1.3.1.4 瓊脂糖凝膠電泳和圖像分析 取10 μL PCR擴增產物、2 μL上樣緩沖液、1 μL Syber-green混勻，向2.0%瓊脂糖凝膠孔中點樣，設定電泳條件：電壓120 V，電流50 mA，電泳后取出凝膠，在紫外燈下觀察并進行掃描及拍照，目的基因及β-actin擴增產物在紫外燈下的熒光條帶與Maker比較后，顯示擴增產物大小與預期相符。分別為RhoE 169 bp；EGFR 341 bp；β-actin 660 bp；見圖1、2。用UVIbland凝膠圖像處理軟件對擴增產物RhoE、EGFR和β-actin的表達強度進行分析，并計算各個基因的表達相對系數（即目的基因表達強度/β-actin的表達強度）。
1.4 統計學處理 運用SPSS 17.0對所得數據進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較使用t（或t"）檢驗，對于三者或者三者以上之間的比較則應用單因素方差分析以及非參數檢驗等統計學方法進行分析，以P<0.05認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 RhoE與EGFR在食管癌組織及正常組織中的表達 RT-PCR結果顯示，食管癌組織中RhoE蛋白呈低表達，EGFR蛋白呈高表達，見表3。
2.2 RhoE與EGFR基因的表達與食管鱗癌的臨床病理指標之間的關系 RhoE與EGFR表達水平的高低與食管鱗癌的分化程度、浸潤與否、淋巴轉移以及病理分期都有著密切的關系（P<0.001），但是與腫瘤的位置、大小和分型無關（P>0.05），見表4。
2.3 食管鱗癌組織中RhoE與EGFR表達的相關性 運用Spearman秩相關分析對食管鱗癌組織中RhoE與EGFR mRNA的相對表達系數進行分析，結果顯示r=-0.812，P<0.01，提示兩者在食管癌組織中的表達呈負相關。
3 討論
RhoE又稱Rnd3，屬于一種小分子G蛋白 [2]；它獨特的結構及特點決定了它許多特異的功能。RhoE在很多腫瘤中都存在異常表達，并呈現出一定的特異性[3]。研究表明RhoE可以通過抑制Ras→Raf→MEK→ERK信號通路的傳導而抑制細胞周期的進展。Zhao等[1]發現，食管鱗癌體外癌細胞中RhoE基因表達的上調，可以抑制細胞的增值、降低癌細胞的侵襲性、促進細胞的凋亡。
EGFR屬于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，EGFR的經典信號傳導通路有：PI3K/PDK1/AKT通路、Ras/Raf/MAPK通路、STATs通路、PLCγ/CaMK/PKC通路。EGFR的核內信號通路屬于非經典的信號傳導通路，此通路啟動后，可以使細胞周期的進程加速[4]。現有研究發現，多種惡性腫瘤細胞的增值、侵襲及轉移與EGFR表達水平上調密切相關[5]。
由上述各研究結果可以看出，EGFR和RhoE均作用于Ras傳導通路，但兩者所起的作用不同，甚至在某些方面是恰恰相反的，目前尚沒有研究證明兩者之間有無聯系以及有著怎樣的聯系。根據本實驗的研究數據不難發現，在食管鱗狀細胞癌中，RhoE可能是一個候選的抑癌基因，并反饋抑制EGFR的高表達。因此筆者考慮在進一步的實驗中擬通過基因沉默及過表達的方法人為的提高或降低RhoE的表達水平，同時檢測EGFR的表達水平，并進一步行動物實驗構建食管鱗癌動物模型。如果實驗成功，將能夠為延緩食管癌的發展、提高患者的生存率、充分評估預后生存以及為食管癌的臨床治療提供新的思路和方法。
參考文獻
[1]Zhao H， Yang J， Fan T.RhoE functions as a tumor suppressor in esophageal squamous cell carcinoma and modulates the PTEN/PI3K/Akt signaling pathway [J].Tumour Biol，2012，33（5）：1363-1374.
[2] Foster R， Hu K Q， Lu Y， et al. Identification of a novel human Rho protein with unusual properties； GTPase deficiency and in vivo famesylation[J].Mol Cell Biol，1996， 16 （6）： 2689-2699.
[3] Belgiovine C， Frapolli R， Bonezzi K， et al. Reduced expression of the ROCK inhibitor Rnd3 is associated with increased invasiveness and metastatic potential in mesenchymal tumor cells [J].PLoS One，2010，5（11）： 141-154.
[4] Hsu J M， Chen C T， Chou C K， et al. Crosstalk between Arg 1175 methylation and Tyr 1173 phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation[J]. Nat Cell Biol，2011，13（2）：174-181.
[5] Al Olayan A， Al Hussaini H， Jazieh A R. The roles of epidermal growth factor receptor （EGFR） inhibitors in the management of lung cancer [J]. J Infect Public Health，2012，5（1）：50-60.
（收稿日期：2014-06-28） （本文編輯：蔡元元）
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